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传物质除了可能是DNA还可能是RNA,而且现在对于RNA病毒的研究居多,所以针对性的技术也与细菌等微生物的遗传学研究技术有所区别.

对于RNA病毒使用最多的是反向遗传学技术,最初即使用反转录PCR得到病毒RNA的cDNA,从而完成病毒基因组的探索工作,以达到了解或有目的性改造病毒基因组实现生产应用的目的.此法对于类型多样的病毒研究提供的最为基础的遗传学数据,为疫苗开发筛选、新型病毒载体等多方面都给予有力的技术支持.

针对病毒易变异的特点,单链构想多态性检测技术(SSCP)则理想地解决了这一问题.近年来,对于多种模式生物的基因组测序的发展,越来越多的研究开始着重于探索基因变异的问题,而SSCP技术正是这样发展起来的.其主要用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入,为病毒的分子演化规律以及流行病学提供充分的证据.

基因芯片技术的概念来源于计算机芯片,即将大量寡聚核苷酸以阵列形式有序固定于载体表面,与待测样本的病毒分子杂交,然后利用化学发光或同位素等显色方法,用CCD等仪器对杂交信号进行高效检测分析.主要用于病毒基因表达谱和基因多态性等方面的研究.

3.2病毒表达机制的研究

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在病毒的表达机制研究中,主要是利用不同的检测手段,判断病毒表达的具体情况,并对于病毒表达的情况进行总结归纳,研究其时空上的机制和规律.

NorthernBlots即针对病毒RNA样品的技术手段,原理与SouthernBlots相似,利用探针与固相RNA杂交,再对探针分子的图像进行捕获和分析.此法特异性高,常用于分析已知基因的表达情况.

mRNA表达差异技术主要使用反转录PCR以及等量不同宿主的定量检测,来确定抗病种和感病种的差异表达基因,从而进一步确定造成品种差异的原因.

3.3病毒蛋白质的研究

病毒蛋白决定了病毒的形态结构,常作为抗原来激发人体内的免疫反应,作用于宿主细胞信号转导途径,导致宿主细胞内信号转导发生紊乱;并且一些病毒蛋白具有酶的作用,可作为细胞毒素作用于宿主细胞.

大范围而言,病毒蛋白质研究的技术,都隶属于蛋白质组学的研究范畴之内,只不过针对不同特性的蛋白,往往会选取最为有效而简便的技术方法进行研究.而由于蛋白质分子结构、化学生物特性等多方面差异很大的特点,其针对性技术也是五花八门,在此仅列举较为常用的技术,以供研究者学习参考.

经典的方法有亲和层析、抗体受体法、抗细胞受体法、抗独特型抗体法、病毒覆盖蛋白法.大多还是利用病毒蛋白和抗体蛋白或者其他蛋白或大分子物质的作用,来检测病毒蛋白的特性.虽然这些方法快速简便,但是由于方法本身较为粗糙,样品用量较大,准确性存疑等问题,现在仅在低要求情况下使用.

现代的方法则更加丰富,也分别具有各自的特点,常被运用于现在的病毒蛋白的研究.

噬菌体表面呈现技术是利用噬菌体本身表达的两种结构蛋白会暴露在噬菌体表面,故将外源基因倒入两个结构蛋白基因间,使外源序列一起表达,然后让表达产物与大量配体结合,筛选特殊结合性配体.但此法表达出来的蛋白可能与天然状态不符,所以使用较为受限.

免疫共沉淀是一种成熟蛋白作用技术,其原理为在溶液或细胞中,用一种蛋白的抗体耦合可与此蛋白特异结合的另一蛋白,从而形成一抗体两蛋白的沉淀,从而获取具有结合饵蛋白能力的未知蛋白,探索细胞中蛋白作用机制.

酵母双杂交技术是利用真核基因的特殊表达机制,通过将两个蛋白的编码序列整合在同一酵母细胞内的特殊转录激活域附近,若两种蛋白可以发生相互作用,则会激活相应的报告基因,从而报告蛋白的相互作用.此法常用于筛选病毒蛋白的特异膜蛋白受体.

除了以上列举的技术之外,还有cDNA文库技术、质谱分析技术、GSTPull-down技术、串联亲和纯化、荧光能量共转移等多种技术应用于蛋白互作的研究.

参考文献

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