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摘 要：基因植物疫苗已成为疫苗研究领域的一个新热点,本文简单介绍了植物疫苗的免疫原理、植物疫苗的特点、植物疫苗生产的表达系统、以植物为载体的免疫技术、植物疫苗的安全性、植物基因工程疫苗研究进展、基因工程在植物疫苗中的应用以及展望等.
关 键 词：植物疫苗；基因工程；表达系统；安全性
1植物疫苗的免疫原理
植物疫苗可诱导粘膜免疫反应,小肠淋巴组织的粘膜上有一种特殊的细胞叫做膜细胞（M细胞）.粘膜免疫应答就是由M细胞识别抗原开始的.M细胞识别抗原并将其传递给巨噬细胞,巨噬细胞和其它抗原呈递细胞,再将抗原展示给辅助性T细胞,辅助性T细胞识别外源蛋白质片段后就会刺激B细胞制造和释放能中和抗原的抗体,当疾病因子出现时,记忆辅助性T细胞刺激胞毒T细胞攻击受感染的细胞,同时它迅速刺激记忆B细胞分泌中和抗体消灭入侵的病原体.总的来说,转基因植物疫苗可以诱导相应的血清型的IgA和IgG反应.
2植物疫苗的特点
2.1安全性高
植物是人类食物来源之一,除个别人群对某些特定的植物过敏外,其安全性高.用动物细胞生产疫苗,可能有动物病毒的污染,对人类存在潜在危害.而植物病毒不会感染人类,比较安全,同时也可避免微生物生产疫苗带来的有害产物.
2.2成本低
植物种植系统简单易行,植物细胞培养条件简单,便于进行遗传操作,可通过大面积栽培获得廉价的疫苗,且不需要技术、设备和种植条件等巨大投资.农作物可以当地生产,还易于储藏和运输,而且经过长期种植,植物栽培、收获、贮藏、加工程序已经形成工业化.与植物生物反应器相比,原核生物反应器与动物生物反应器生产时需要昂贵的技术设备、大量的人力物力.
2.3植物具有完整的真核表达系统
具有与动物相同的真核加工修饰系统.可以对重组蛋白进行糖基化、磷酸化、酰胺化、亚基正确装配等.微生物系统不能对真核生物蛋白进行正确的翻译后加工.
2.4转基因植物中的外源基因可重组
通过植物杂交的方法进行基因重组,进而在植物体内积累多种病原体的抗原基因,生产出方便高效的多联疫苗.
3植物基因工程疫苗外源基因的表达系统
3.1瞬时表达系统
主要采用植物病毒作为载体,而外源基因插入到病毒基因组中,通过病毒感染植株,从而将外源基因导入植物细胞内,采用这种转化方式,外源基因并不整合至植物基因组中,只是利用寄主细胞在细胞质中进行复制,以高拷贝的形式游离于植物中,并进行高效的表达,因此可在短时间内在植物细胞内积累大量的外源蛋白.采用农杆菌介导的转化,外源基因蛋白的产量一般要低于细胞内可溶性蛋白总量的1%；而采用这种瞬时表达系统,外源基因蛋白总量会远大于1%.
3.2稳定整合系统
3.2.1土壤农杆菌介导的遗传转化.目前根癌农杆菌主要用于双子叶植物的遗传转化,其转化植物的机制已从分子水平上基本得到解释.而发根农杆菌,由于对Ri质粒了解得还不充分,所以对这种转化系统的研究主要集中在以生产次生代谢产物为目的的根组织培养和根的发育.采用农杆菌介导的植物转化最常采用共培养法,即使用农杆菌菌液与叶盘、愈伤组织、悬浮培养细胞、茎段、下胚轴段、子叶切片等部分进行共培养,从而达到转化的目的.
3.2.2外源DNA直接导入法.主要包括基因枪法、电激发、PEG诱导法、激光穿孔法、脂质体法、超声波法,其中最常用的是基因枪法.它是将带有外源基因的质粒用亚精胺包裹为直径1μm左右的金弹或钨弹,再用高压氦气、火药爆炸力、高压放电气体作为动力加速子弹,使它们穿过植物细胞壁和细胞膜,将外源基因带入具有再生能力的植物组织,这样可以在很大程度上缩短再生的时间,从而避免体细胞变异的发生.
该文转载于 http://www.sxsky.net/benkelunwen/060345240.html
4以植物为载体的免疫技术
4.1植物疫苗免疫原性和免疫保护作用
由于植物疫苗一般是通过食用来被人体利用.所以如何避免消化酶的影响来保护抗原就是一个重要的研究课题.目前,避免消化酶的影响来保护抗原可分为2类方法：①用沙门氏菌和弧状霍乱杆菌作为载体；②用保护性的包被对抗原进行包装.
用减毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面,有利于粘膜免疫系统摄取所表达的抗原.但是基于减毒菌株的方法具有潜在安全缺陷,而后者可通过生物降解的多聚物、脂质体、蛋白质体或者表达抗原的转基因植物来实现.许多研究表明,植物材料可潜在地保护所选定的抗原.特别在种子中,植物可为亚单位疫苗提供一个富含蛋白酶抑制物的糖类聚合物基质环境.其它的抗原包装方法需要烦琐的处理步骤；而通过植物种子来进行生物包装不需要任何额外的代价,就可以为这些抗原提供保护.在有关转基因马铃薯的研究中,从轮状病毒和产肠毒素大肠杆菌中所选的抗原分别与霍乱毒素的B和A2亚单位融合,抗原的免疫反应显示出对Th1的偏爱性,并可诱导白细胞介素2和干扰素γ,CD4+水平也相应增加.Th1的偏爱性很可能是抗原或者载体的选择结果.在佐剂的帮助下,亚单位疫苗的释放能增加免疫反应量.霍乱毒素和大肠杆菌的热不稳定毒素,它们与抗原共表达,有利于诱导保护性的免疫产生,改变口服免疫低效率递呈.另外,有人证实了转基因植物疫苗的粘膜传输中所诱发的免疫应答所具有的黏膜佐剂的特征,这给口服免疫可不需佐剂提供了依据,同时也提高了其安全性.
在以植物疫苗的口服免疫研究中,所候选的亚单位疫苗也具有较好的保护作用.马铃薯块茎或谷物种子中表达的热不稳定毒素的B亚基和马铃薯中表达的霍乱毒素B亚基用于小鼠口服免疫,可以保护老鼠免受痢疾的感染.另外,口服免疫由谷物种子表达的传播性肠炎病毒的S2糖蛋白,对乳猪能够起到很好的保护作用.目前,通过植物递送系统来生产B型肝炎的疫苗也逐渐成熟.
4.2提高抗原在植物中的表达水平
利用植物进行疫苗开发,首要的问题是,植物能否表达相关的蛋白?目前为止,许多亚单位候选抗原在转基因植物中成功表达,这些抗原主要包括感染人类、家畜、野生动物的细菌和病毒抗原.表达水平很大程度上取决于表达的蛋白和用于表达的植物种类,同时,构建的表达系统也影响抗原的表达水平,比如用于表达的细胞器基因组(核和质粒)、启动子的强度和组织专一性、非翻译前导序列和信号序列的选择和表达蛋白的靶细胞器的定位等均对表达产生影响.一般而言,利用上述策略可以实现抗原高水平表达.然而,很难对表达系统进行比较,因为特定抗原对植物表达系统的选择很重要,在不同的系统中其表达效果是不一样的.近来,研究人员利用内质网滞留信号可提高外源基因的表达量,Mason等利用一个核表达系统,把蛋白定位于内质网滞留信号之后,热不稳定毒素B亚单位在马玲薯块茎中表达量可达总可溶性蛋白质的0.2%；在谷物种子中的表达量约占总可溶蛋白的4%或12%,这些都依赖于所用的调节序列.另外,霍乱毒素（B）亚单位在利用内质网滞留信号时在烟草叶片中的表达量约占总可溶蛋白的4%.膜蛋白比可溶性蛋白更难于在转基因植物中表达,大量研究表明,膜蛋白在植物中的表达量远不及可溶性蛋白,这就需要优化表达系统以提高表达水平.
目前,转基因马玲薯表达B型肝炎的表面抗原水平已由马玲薯大约1mg/g增加到马玲薯大约16mg/g抗原,这样可以大大减少口服剂量.目前许多研究表明,所欲表达的抗原在植物中能够表达并装配成四级结构.糖基化修饰的蛋白也可在植物中进行糖基化,尽管糖基化模式很可能存在着差别.在植物系统中表达的热不稳定蛋白毒素的B亚单位和霍乱毒素的B亚单位,均有GM1受体结合活性,B型肝炎表面抗原和诺沃克病毒衣壳蛋白可形成类病毒颗粒,类病毒颗粒的形成,可认为有利于诱导免疫反应.
5植物基因工程疫苗研究进展
5.1反转录病毒载体
反转录病毒作为载体是在进行动物基因工程中发现的,许多研究人员认为它同样适于植物基因工程,但目前研究的不多.
5.2单链RNA植物病毒
单链RNA植物病毒,即病毒RNA可直接作为mRNA的植物病毒,主要包括苜蓿花叶病毒(ALMV)、豇豆花叶病毒(CPMV)、雀麦花叶病毒(BMV)、烟草花叶
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