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摘 要:在当前的实验室条件下自然界中约有99%的微生物不可培养,这使微生物资源的开发利用受到了限制.宏基因组技术通过不培养微生物而直接对环境中总DNA进行克隆筛选来突破这个瓶颈.宏基因组技术现在已经用于各种微生态环境的研究中,大大加深了我们对环境中的微生物多样性以及微生物功能的认识.

关 键 词:宏基因组,不可培养微生物,筛选系统

中图分类号:Q75文献标识码:A文章编号:1674-0432(2010)-06-0044-3

0引言

Woese和Pace基于16SrRNA或DNA基因序列分析的先锋研究工作给微生物生态学领域带来了革命性的变化.在此之前,人们完全没有意识到真实存在于自然界和在实验室能培养的微生物数量之间重大的差别.伴随着克隆和测序技术的发展,细菌通用引物对环境中生物群落总DNA的直接PCR扩增,产生了大量的数据并重新定义了原核生物的多样性.近年来一些学者对微生态学和宏基因组进行了研究.以下是近几年报道的关于不可培养的大多数微生物的新的见解和技术.

1宏基因组的研究

1.1DNA的分离

环境样品DNA的质量直接关系到宏基因组分析的质量.Tiedjie等发展了从不同类型的土壤中直接分离DNA的方法,但是这些方法仍然不能确定在所有的具有代表性的高度复杂的生物群落中能够获取全部的总DNA.尽管Coutois等人发现,从土壤中直接提取DNA和先从土壤分离细胞再从中提取DNA所得到的细菌多样性范围并无重大差别,但是Luna等人证实,在检测海水沉淀物时,只用单一的DNA提取方法严重低估了细菌多样性.不同的方法适用不同的环境.比如,Fortin等人发现,在细胞裂解前冲洗被碳氢化合物和重金属严重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的质量.

选择一种DNA提取方法用于宏基因组分析需要分析样品的信息.在预测一个生态环境中不同的微生物群落成员的潜在功能的时候,分辨DNA来自样品来自可培养的微生物还是来自死细胞是很有价值的.Nocker和Camper表明,用ethidiummonoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16SrRNA基因指纹图谱,提取处理过的样品和未经处理的样品的DNA有重大的区别.对环境中的活体,很有必要区分DNA来自胞内还是胞外.水沉淀中包含了大量来自胞外的DNA,Corinaldesi等人改进了一种允许同时提取胞内和胞外DNA的方法,这些DNA可能对细菌的新陈代谢起着重要的作用.

1.2系统发生和宏基因组的分析

DNA提取方法的改进、测序手段的进步和测序成本的降低使我们能够解决以下问题:在一个群落中不连续的单元里共生多少种类的细菌以及环境中是什么因素影响着群落的组成和多样性.Acinas等运用不同的PCR扩增方案建立了两个独立的沿海浮游生物的16SrRNA文库.这两个文库的比较表明了PCR扩增可能会高估文库中独特的rRNA序列.尽管如此,PCR的误差仍然不能说明样品中的所有16SrRNA基因的微小差异(1%的序列差异).97种已完全测序细菌全基因组比较表明,它们包含242种属于非同源多操纵子的不同16SrRNA基因.序列分析还表明任何基因组中的16SrRNA内部操纵子的差异在1%以内.引入一个修正参数2.5(242个rRNA操纵子和97个基因组相除)到浮游生物样品待测序的序列中,以99%的相似性(1113)为标准,Acinas等预测这些样品中至少包含了446种紧密相关的基因组.因此这些数据间接的表明了这个种群内部包含有大量相似的种类.基因序列也开始用于推断一个群落中各个体的角色和功能,这比仅确定群落中的种类更有意义和更具挑战.

在低度多样性环境中,普通的测序就能得到环境中的微生物信息.比如在一个种群细菌复杂程度不高的酸性矿井排水装置中的生物膜中,可以对单个菌株的代谢途径进行分析.在Tyson等人的研究中,细菌种群只由五种主要的种类组成,而且其中两种几乎存在所有的覆盖面积内.而许多自然环境中种群结构高度复杂,不能采用现在的方法.据估计在一份农场土壤样品中有超过5000种,104-105株的细菌.要得到这些复杂环境中占有最优势地位的细菌种类的八倍的覆盖量,必须产生二十亿到五十亿个碱基对的序列.为了避免对全基因组集合,Tringe等大量使用未集合的序列来读取一定时期内环境中标记基因.基因定量包括对特定生态环境能反映已知环境特点的环境样品的分析.以基因比较为中心对特定环境中基因定位给我们更好地认识和解释环境带来了新的机遇,也提出了新的问题.

处理复杂环境的另一条途径是将许多种类混合的16SrRNA基因克隆到单一的载体里面.其中,SARST(serialanalysisofribosomalsequencetags)发现了V1或V6高变区.这些位于核糖体小亚基rRNA上的高变区(叫做V1或V6区)长度大约为17-55bp,这些复杂的生物体中的片断可以连接到单个的克隆里面去.用这种方法,单个测序反映能达到的序列标记可达20个.这种方法可以鉴定菌群可达到属的水平.vanderLelie等人报道了一种改变的序列标记方法,用于基因组中短的保守序列,结合限制性内切酶消化产生标记,可以区分亲缘关系很近的菌株.一些细菌的保守基因已经鉴定出来,包括rpoC,uvrB,recA和16SrRNA基因.在这些基因中,16SrRNA是差别最大而且可以应用于所有的原核生物种类分析的基因,可以达到属的水平,很大一部分还可以分辩到种的水平.

近年来,以16SrRNA基因为基础的微生物分类阵列已经成为鉴定微生物区系的最有力的方法.这种微生物分类阵列由大量不同门类的细菌的标记探针组成.不同原型的阵列已经发展并开始用于估计环境种群中微生物的多样性.这种以16SrRNA基因为基础的微生物分类阵列将成为监测各种复杂环境中微生物多样性的一个最重要的工具.

复杂环境中微生物区系指纹图谱和宏基因组分析将来可能发展为基因芯片.一个完全的综合芯片到目前为止仍然是一个对未来的展望.Hong等人描述了一种基因芯片的概念,这种芯片通过分离不同种类和数量的细菌或哺乳动物的细胞并裂解提纯DNA或者mRNA来实现.基因芯片的研究对我们认识和监测一定的微生态环境中微生物种群结构的认有着非常重要的意义.

直到今天,宏基因组的研究还只在生物量相对较高的环境中进行.在对细胞、量很少的环境进行宏基因组的分析还需要一种新的文库构建方法.Abulencia等描述了一种多态性扩增严重污染的土壤中有机体基因组的方法.从严重污染和细胞密度极低

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