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40;烟草植株体内的POD,SOD,PPO酶活性均呈先上升后下降的趋势.邱思鑫[1]的研究结果也表明,内生菌液处理的辣椒苗体内的POD,SOD酶活性显着增加.SOD在,它可以清除O2一以避免对细胞的伤害.Keppler等[8]研究发现,O2一对POD而言,它不仅参与了木质素的沉积过程,而且在清除H2O2和O2一自由基方面具有重要防御作用.PPO是细胞抗性酶之一,其作用机制是将细胞代谢产物中的酚类物质氧化为醌类来杀死细胞限制病原物进一步扩展.第五章植物疫苗对不同作物根际土壤微生物群落结构的影响
5.1引言
无致病力青枯雷尔氏菌在植物青枯病防治中具有重要的生防应用潜力[].它利用生物诱导抗性的原理,在植株苗期接种病原弱株系,经过侵入,定殖,在植株体内形成营养和位点竞争[],构建植株体内微生态平衡,诱导植株产生抗病能力,从而阻碍病原菌的蔓延,形成植物疫苗的作用,抑制病害发生.本实验室经多年研究获得一株植物疫苗菌FJAT-1458,对番茄的盆栽苗试验防效均达70%以上,具有较好应用潜力.虽然国内外许多研究已证明利用病原菌无致病力菌株进行生物防治,在植物病害防治方面具有很好的作用效果[1],但是,对这种作用效果的机理了解甚少.青枯病发生与植株根系土壤微生物群落结构关系密切[1],试图利用无致病力青枯雷尔氏菌浇灌作物根系防治青枯病,从胁迫后的不同作物根系土壤微生物脂肪酸生态学特性的变化,来分析其对不同作物根系土壤微生物群落结构影响,解释其作用机理,相关的研究未见报道.
对土壤微生物群落多样性的研究通常采用传统培养物进行培养和分离,传统培养分离的微生物只占总数的0.1%～10%,不能全面反映土壤微生物多样性信息.磷脂脂肪酸(PhospholipidFattyAcids,PLFAs)图谱分析是近几年来发展的研究土壤微物群落结构的一种新方法,它可定量分析微生物群落的生物量和群落结构,该方法在土壤的微生物群落组成和种群变化方面研究得到越来越广泛的应用[],用于揭示植被,植物栽培及土地管理方式,有机污染物,重金属,季节变化,气侯条件及其它方面等诸多因素对土壤微生物群落结构和生物量的影响.
本研究对不同根际土壤接种无致病力青枯雷尔氏菌,通过引入磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记分析青枯雷尔氏菌无致病力菌株胁迫对不同作物根系土壤微生物群落结构的影响,从生态学角度揭示青枯雷尔氏菌无致病力菌株产生免疫抗性的机理,为青枯疫苗的研发提供理论依据.
5.2材料与方法
5.2.1供试材料
芹菜根际土壤,番茄根际土壤,丝瓜根际土壤,辣椒根际土壤,茄子根际土壤,采样时间为2016年10月,采自福建莆田,取样植株均为成熟期植株的根系土壤.
5.2.2试验方法
5.2.2.1植物疫苗胁迫接种和取样方法
采用盆栽试验,使用直径5cm,高5cm的塑料盆,每盆装不同根际土壤0.5kg(购自厦门市银农种苗有限公司),将发酵培养的FJAT-1458菌液稀释浓度至1.0×106cfu/mL,采用灌根接种法,每盆接种发酵培养的FJAT-1458菌液稀释50mL,每个处理3盆重复,设清水对照处理3盆.在接种后第3d,6d,9d,12d,15d,18d和21d取样.取样方法:每盆土壤混合,拌匀收集10g土样-80℃冰箱保存备用.
5.2.2.2磷脂采用磷脂脂肪酸PLFAs)生物标记法进行土壤微生物群落结构分析.磷脂脂肪酸的提取过程和分析参考Frostegrd等和Kourtev等方法[1,109]并略作修改.提取过程分4个步骤:脂肪酸的释放与甲酯化,溶液的中和,脂肪酸的萃取,脂肪酸溶解.
具体操作如下:在50mL离心管中分别加入10g垫料和20mL0.2mol的KOH甲醇溶液,充分混匀,并于37℃水浴1h每10min斡旋样品1次,加入3mL1.0mol的醋酸溶液调节pH值,充分摇匀,加入10mL正己烷,充分摇匀,在2000rmin条件下离心15min,将上层正己烷相转入干净玻璃试管中,吹干(注意:此过程要小心,宁可少取有机相,绝不可吸入甲醇相,否则会损坏气相色谱仪的色谱柱.)加入0.5mL体积比为1:1的正己烷和甲基叔丁基醚混合溶液,充分溶解,转入GC小瓶,用于脂肪酸测定.
采用美国Agilent6890N型气相色谱仪测定PLFAs成份,包括全自动进样装置,石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器.在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物标样和待检样本:色谱HP2ULTRA2(25m×0.2mm×0.33μm),分流进样,进样量lμL,分流比为100:1,载气(H2)流速为2mLmin-1,尾吹气(N2)流速为30mLmin.二阶程序升高柱温:以5℃min的速率使柱温由170℃升至260℃,再以40℃min的速率升温至310℃,保持90s.汽化室温度为250℃,检测器温度为300℃,柱前压10.00psi1psi等于6.895kPa).PLFAs成份分析采用美国MIDI公司(MIDI,Newark,Delaware,USA开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定的SherlockMIS4.5系统SherlockMicrobialIdentificationSystem),系统根据各组分保留时间计算等链长(ECL)值以确定目标组分的存在,采用峰面积归一化法计算各组分的相对含量.磷脂脂肪酸分子式以A:BωC(c/t)示,其中A"代表脂肪酸分子的C原子总数,B"代表不饱和烯键的数目,ω"代表烯键距离羧基的位置,C"为烯键或环丙烷链的位置,后缀c"和t"分别代表顺式和反式同分异构体.
5.2.2.3数据分析
(1)土壤微生物种类的磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记的识别.Bardgett等[]认为土壤中磷脂脂肪酸的组成可以表示土壤微生物群落的生物量和结构.由于磷脂脂肪酸存在于所有活体细胞膜中且随菌体死亡而迅速降解,与微生物量之间具有高度相关性,因此可以很好地标识微生物的生物量.其中,18:1ω9c,18:2ω9,12,18:2ω69c等多烯脂肪酸为真核生物所独有[1],其总和可指示真菌生物量,而一些含有以酯链与甘油相连的饱和或单不饱和脂肪酸如i15:0,a15:0,16:0,i16:0等的总和可代表细菌总脂肪酸,指示土壤细菌总量[1],指示放线菌的脂肪酸种类有10Me16:010Me17:0和10Me18:0[].
(2)分析:Shannon-Wiener,优势度指数Simpson和数Pielou,分析不同处理根系土壤-∑PilnPi
Simpson指数:C等于1-lnS
式中,S为Pi等于ni/N,ni为i类N为该试验中总脂肪酸个数.
5.3结果分析
5.3.1植物疫苗胁迫下不同作物根系土壤微生物PLFAs测定
试验结果见表5-1.茄子,辣椒,丝瓜,番茄,芹菜根系土壤种PLFAs3d,6d,9d,12d,15d,18d,21d分别检测到62,57,61,53,52,56,61种PLFAs对照处理的茄子,辣椒,丝瓜,番茄,芹菜根系土壤种PLFAs.3d,6d,9d,12d,15d,18d,21d分别检测到58,59,48,53,50,46,56种PLFAsPLFAs标记种类繁多,其中,包含各种饱和的磷脂脂肪酸,如14:0,15:0,16:0等,不饱和的磷脂脂肪酸,如18:1ω9c,17:1ω8c,16:1ω5c等,分支的磷脂脂肪酸,如a15:0,a16:0,i16:0等,环化脂肪酸,如cy17:0和cy19:0ω8c,说明根系土壤微生物群落PLFAs种类丰富.表5-1FJAT-1458胁迫下不同作物根系土壤微生物PLFAs类型和含量(nmol·g-1)
Tab.5-1TypesandconofdiffentplantrhizospheresoilPLFAsbystrainFJAT-1458treatmenting
脂肪酸标记茄子根际土壤辣椒根际土壤丝瓜根际土壤番茄根际土壤芹菜根际土壤处理组对照组处理组对照组处理组对照组处理组对照组处理组对照组i13:03OH0.0100.0270.0560.1490.0470.1040.0490.0470.0000.01610:03OH0.0360.0400.0530.1040.0600.0940.0590.0930.0170.061a15:1A0.0890.0000
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