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5;1458

2.2.3番茄青枯病植物疫苗工程菌FJAT-1458的接种时间对番茄青枯病防效的影响

试验结果见表2-3,回接4d后,的番茄苗开始出现萎蔫现象,表现出青枯病的症状,第6d发病率为25%,并且随着时间的推移而日益严重,在回接后11d,所有植株都发病,发病率达100%.而经伤根处理接种植物疫苗菌株的番茄苗较对照均推迟发病,接种植物疫苗工程菌FJAT-1458的处理较对照分别推迟3,2,2d发病.接种10d后,防效分别为60%,45%,45%2生长正常.比较接种植物疫苗工程菌FJAT-1458的三组处理,0d组平均防效最好,3d6d组防效差异不大.

表2-3不同天数接种FJAT-1458后番茄青枯病的发病率Tab.2-3ThemorbidityoftomatobacterialwiltwithdifferentdaysofFJAT-1458

回接天数(d)不同处理0d3d6dck1ck250.000.000.005.000.0060.005.0010.0025.000.0075.0010.0030.0075.000.00815.0025.0040.0085.000.00915.0045.0045.0095.000.001020.0055.0055.0095.000.001130.0060.0055.00100.000.001245.0060.0055.00100.000.001355.0060.0060.00100.000.001455.0070.0065.00100.000.001560.0075.0070.00100.000.001665.0075.0070.00100.000.001765.0075.0075.00100.000.001875.0080.0080.00100.000.001985.0085.0080.00100.000.002085.0085.0080.00100.000.002585.0090.00100.00100.000.00

2.3.4试验获得番茄青枯病植株病原菌的的利用特异性引物对pehA#3和pehA#6进行的鉴定,鉴定结果如图2-3所示,扩增片断大小约为500bp.图2-3利用特异性引物对10株菌株鉴定的结果Fig.2-3MolecularidentificationoftenRalstoniasolanacearumstrainswithspecificityprimers

M:3000bpMarker,+:RalstoniasolanacearumGMI1000,-:CK,Serialnumber:Unidentifiedstrains2.4讨论通过对青枯雷尔氏菌自然突变株和Tn-5插入致弱菌株进行致病性和防效鉴定自然突变株FJAT-1458防效最好,在整个调查期内发病率为0因此选择FJAT-1458作为植物疫苗进一步研究.工程菌FJAT-1458当工程菌FJAT-1458浓度小于1×106cfu/mL时,番茄青枯病的,1×108cfu/mL时,番茄青枯病的.,同时接种工程菌FJAT-1458和菌株FJAT-91,,工程菌FJAT-14583d,6d再接种菌株FJAT-91,番茄青枯病的发病率较高,致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91处理25d后发病率分别为85%,90%,100%.


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接种高浓度的植物疫苗FJAT-1458的番茄植株发病率较低,可能是由于青枯雷尔氏菌的强致病力与无致病力菌株生长存在竞争关系人工大量施用植物疫苗时,能有效地保护番茄植株在生长初期免受青枯病的危害在短期内起到一定的防治效果的原因所在,且两种菌株施用时间越相近,植物疫苗菌株能较快成为优势种群.但随着时间的延长,番茄青枯雷尔氏菌的强致力菌株有着比无致病力菌株更强的生长能力[],强致病力菌株又重新成为优势种群.这可能是导致防效迅速下降的原因之一

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第三章植物疫苗FJAT-1458在番茄植株的定殖特性

3.1引言

目前有大量青枯病病原菌及无致病力菌株在植株定殖分布的文章,刘波等[]研究了青枯雷尔氏菌在植株体内分布及其致病力的异质性,表明青枯雷尔氏菌能在植株体内定殖杨宇红等[]利用无致病力hrp2突变体防治茄科蔬菜青枯病,并采改良蘸根接种法用无致病力hrp2突变体预处理,能有效提高青枯病防治效果判断筛选的生防菌株生防能力如何,最重要的就是其能否在寄主植物根围及植株体内定殖.利用番茄幼苗研究了植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄幼苗不同时期不同部位的定殖情况这对我们进一步利用防治青枯病具有重要的意义.3.2试验材料

3.2.1供试供试病原菌FJAT-91及植物疫苗工程菌FJAT-1458均由福建省农科院农业生物资源所微生物研究中心提供.

3.2.培养基

TTC/L:蛋白胨10.0g,水解酪蛋白1.0g,葡萄糖5.0g,TTC(23,5-氯化三苯基四氮唑)0.05g,pH7.0-7.2(注:TTC用蒸馏水配成1%溶液并用细菌过滤器过滤灭菌,在培养基倒平板前(冷却至约50℃)每100.mL培养基加入0.5mL.)

SPA培养基:5g蛋白胨,20g蔗糖,0.5gKH2PO4,0.25gMgSO4,1000mL蒸馏水,分装,121℃灭菌20min,最终pH值为7.2-7.4.

3.2.供试番茄

金石王1号番茄实生苗培育2-3叶期幼苗5-6叶期成苗番茄种苗购自厦门如意集团农业科技有限公司.

3.试验方法

3..1菌液的制备

将划线于TTC琼脂平板上,在30℃条件下培养48h,挑取单菌落于装有50mLSPA培养液的250mL三角瓶中,于30℃,200r/min摇床培养48h.将菌液混匀,,确定菌液的原始浓度,数量级为109,根据试验需要稀释,备用.

3..2植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄植株不同部位的定殖数量

将菌液混匀,用平板涂布计数,确定菌液的原始浓度,数量级为109,依次稀释到104cfu/mL106cfu/mL(处理2),108cfu/mL(处理3)浓度.用稀释后的菌液灌根处理番茄2-3叶期盆栽苗,50mL/盆,每处理30盆,对照用水代替菌液.在接种后3,6,9,12,15,18,21d取样,每个处理随机取3株番茄植株,测定FJAT-1458在土壤及植株各部位的定殖情况.

3..3植物疫苗工程菌FJAT-1458在番茄不同生长期的定殖数量比较

用稀释后的106cfu/mL植物疫苗工程菌FJAT-1458菌液浓度灌根处理番茄2-3和5-6叶期盆栽苗,50mL/盆,每处理30盆,对照用水代替菌液.在接种后3,6,9,12,15,18,21d取样,每个处理随机取3株番茄植株,测定FJAT-1458在土壤及植株各部位的定殖情况.

3..4土壤青枯雷尔氏菌的分离

土壤称样:称取5g土壤至装有45mL无菌水的三角瓶,摇床振荡15min,使之充分溶解,即配成10-1浓度,稀释土壤原液:吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管,即配成10-2浓度,依次稀释配置成10-3,10-4,10-5.平板涂布:,在振荡器上振荡1-30s,菌液混合均匀吸取200μL,用涂布棒涂匀静置恒温箱培养将涂好的平板用袋子装好倒置于30恒温箱中培养h.菌落纯化:,标记要纯化的菌落标30℃恒温培养箱倒置培养48h.结果计算:每克土样中微生物的数量等于同一稀释度的3个平板上菌落平均数×稀释倍数/含菌样品3.3.5植株体内青枯雷尔氏菌的分离

植株预处理:植株先用清水清洗,用报纸将植株水分吸干.称样及样品处理:称取根,茎基部,茎中部,茎顶部,叶各1g,先用75℅酒精消毒30s再用10℅的NACLO消毒5min,然后用无菌水清洗3遍,再用灭菌滤纸将样品吸干,放至装有10mL无菌水的研钵,充分研磨,即配成10-1浓度,稀释样品原液:吸取1mL原液至装有9mL无菌水的试管,即配成10-2浓度,依次稀释配置成10-3.平板涂布:,在振荡器上振荡1-30s,菌液混合均匀吸取2

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