统计学方面有关论文例文,与CIK细胞不同培养时间的生物学活性相关论文查重免费

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[摘 要]目的探讨CIK细胞培养时间与细胞毒活性的关系.方法抽取恶性肿瘤患者的外周血分离单个核细胞（PBMC）,用细胞因子诱导培养CIK细胞,于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞.用流式细胞仪分析检测CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率及增值率,用MTT法测定其对肺癌细胞株A549杀伤活性.结果培养第21天细胞扩增倍数为（372±1.87）倍,培养第28天细胞扩增倍数为（410±6.52）倍,两者比较差异有统计学意义（P<0.05）；培养第35天CIK细胞扩增倍数为（414±5.16）倍,与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（P0.05）.培养至第28天CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率为（35.6±2.30）%,达最高峰,其后逐渐降低.用MTT法检验不同培养时间的CIK细胞对肺癌细胞株A549的杀伤活性,当效靶比为10∶1时,培养21d的CIK细胞杀瘤率是95%,达最高峰；当效靶比20∶1时培养21d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比40∶1时培养14d的CIK细胞杀瘤率即可达到100%.结论培养时间的延长有利于增强CIK细胞的细胞毒活

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[关 键 词]CIK细胞；细胞毒活性；增殖率；表型

[中图分类号]R-331[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2013）01（a）-0012-03

肿瘤的生物免疫治疗作为第四种治疗手段日益受到重视[1].细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-inducedkillercell,CIK）是肿瘤生物免疫治疗的主力军[2].其主要的效应细胞为CD3+、CD56+表型T淋巴细胞,因此,培养高纯度CD3+、CD56+细胞是提高CIK细胞毒活性,增强对肿瘤细胞杀伤的关键[3].本研究通过体外的CIK细胞毒实验及流式细胞仪分析检测CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率,观察不同培养时间CIK细胞的增殖能力、杀伤活性,以探讨CIK细胞培养时间与细胞毒活性的关系.

1资料与方法

1.1主要试剂

人淋巴细胞分离液FicollPaquePlus,基因重组人IL-2、IL-1、IFN-γ和CD3单抗（Sigma公司）,RPMI1640培养基（美国GIBCO）,小牛血清（NCS）（美国GIBCO）,四甲基偶氮唑盐MTT（华美公司）,二甲基亚砜（DMSO）（Sigma公司,美国）.流式试剂CD3FITC/CD56PE（BD公司,美国）,肺癌细胞株A549均为本实验室保存和传代培养.

1.2实验方法

1.2.1CIK细胞的培养抽取恶性肿瘤患者的外周血,Ficoll密度梯度离心分离单个核细胞（PBMC）,用RPMI1640调整至2×106个/mL进行培养,培养基中含10%小牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、1×105U/L青霉素、100mg/L链霉素和50μmol/L、巯基乙醇、IFN-γ1000U/mL,于当日加入IFN-γ（1000μ/mL）,置于37℃和体积分数为5%的CO2培养箱中培养24h,第1天加入IL-2（1000U/mL）、IL-1α（100μ/mL）、McAb（50μg/mL）,以后每3天换液1次,培养42d,于培养第0、7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞.

1.2.2CIK细胞扩增分析在培养扩增后第7、14、21、28、35、42天分别收取培养的CIK细胞制成细胞悬液,用台盼蓝排除法计数活细胞,并除以初始细胞数,求出实际扩增倍数.

1.2.3CIK细胞的表型分析分别收取培养第0、7、14、21、28、35、42天CIK细胞,用PBS洗2遍,重悬后分别加入1.5mL管中,每管106个细胞,离心后,加FITC标记的抗CD3mAb和PE标记的抗CD56mAb各50μL,于4℃孵育30min.PBS洗2遍,离心后,每管加1mLFACS保存液.用流式细胞仪分析CIK细胞的表型.

1.2.4CIK细胞体外细胞毒活性检测采用96孔培养板用MTT法测定CIK细胞的杀伤活性,收取第0、7、14、21、28、35、42天培养的CIK作为效应细胞,肺癌细胞株A549细胞作为靶细胞,取对数生长期A549细胞调整浓度为1×105个/mL,CIK细胞浓度分别调整为1×106/mL、2×106/mL、4×106个/mL,效靶比依次为10∶1、20∶1、40∶1,分为实验组、效应细胞组、靶细胞组,每组3个复孔,实验组每孔加效应细胞、靶细胞各100μL,靶细胞组每孔加入靶细胞、1640培养液各100μL,效应细胞组每孔加入效应细胞、1640培养液各100μL,置37℃,5%CO2培养箱中培养40h,加入MTT试剂每孔100μL,37℃孵育4h,弃去上清,每孔加入DMSO溶液100μL,震荡溶解沉淀后于全自动酶标检测仪（波长571nm）检测吸光度值（A值）计算杀伤率,杀伤率等于[1-（实验孔A值-效应孔A值/靶细胞孔A值]×100%.

1.3统计学方法

应用SPSS17.0软件包进行统计学处理,计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示,比较采用t检验,计数资料采用百分率表示,组间对比采用χ2检验.以P<0.05为差异有统计学意义.

2结果

2.1采用直接计数活细胞

观察培养第7、14、21、28、35、42天的CIK细胞扩增倍数的变化,结果见表1,培养第21天细胞扩增倍数为（372±1.87）,培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍,两者比较差异有统计学意义（P<0.05）；培养第35天CIK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍,与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（P0.05）.2.2用流式细胞仪分析不同培养时间CIK细胞的表型变化

结果培养第0天CD3+、CD56+双阳性细胞仅占（6.20±1.12）%,第14天达（18.60±4.50）%,第28天为（35.60±2.30）%,达最高峰,其后逐渐降低.见表1.

2.3MTT法检验培养

第0、7、14、21、28、35、42天的CIK细胞对肺癌细胞系A549效靶比10∶1时杀瘤率分别是14%、51%、86%、95%、68%、50%、27%效靶比20∶1时杀瘤率为15%、88%、98%、100%、81%、67%、53%；效靶比40∶1时杀瘤率为17%、98%、100%、100%、95%、75%、70%.见图1.结果显示,当效靶比为10∶1时,培养21d的CIK细胞杀瘤率是95%,达最高峰；当效靶比为20∶1时,培养21d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时,培养14d的CIK细胞杀瘤率即可达到100%.

3讨论

CIK细胞是在体外条件下通过加入不同的细胞因子（IFN-γ、IL-1、IL-2、CD3McAb）刺激外周血单个核细胞培养诱导而成,同时表达CD3、CD56两种膜蛋白分子.与既往临床使用的过继免疫疗法相比,CIK细胞具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞同样敏感、对正常骨髓造血前体细胞细胞毒性小等特点[4],是目前发现的杀伤肿瘤细胞活性强,适合临床应用的一种理想的效应细胞[5],其主要效应细胞为CD3+、CD56+T淋巴细胞,且细胞毒作用几乎唯一存在于CD3+、CD56+表型中.CD3+、CD56+细胞可释放大量的具有细胞毒性的胞浆颗粒而对靶细胞发挥溶细胞作用[6].这种效应细胞在正常外周血中极其少见,仅为1%～5%.已经证实培养过程中CIK细胞毒作用的增加源于单个细胞基础上的细胞毒作用的提高和非活性细胞被激活,成为有细胞毒作用的细胞,即共表达CD56+和CD3+的细胞数量的显著增加[7].由此可见,就免疫治疗来说,足够数量的、高免疫毒性的免疫效应细胞是保证治疗效果的必备条件.李文等[8]报道,CIK细胞总数应>5×109才具有治疗作用.李香丹等[9-11]根据实验研究,认为每杀伤1个肿瘤细胞需要40个淋巴细胞,所以在肿瘤生物治疗中,输注细胞数量与疗效呈正相关,应重点研究如何培养出高数量、高杀瘤活性的CIK细胞.从实验结果可以看出,培养时间可能是影响CIK细胞总数、CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率和CIK细胞杀伤活性的重要因素.因此笔者对不同培养时间的CIK进行了分析,期望寻找CIK细胞最佳培养时间区间.结果显示：培养第21天细胞扩增倍数为（372.00±1.87）倍,培养第28天细胞扩增倍数为（410.00±6.52）倍,两者比较差异有统计学意义（P<0.05）.培养第35天CIK细胞扩增倍数为（414.00±5.16）倍,与培养第28天细胞扩增倍数比较差异无统计学意义（P0.05）.通过流式细胞仪检测不同培养时间CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率,结果显示培养至第28天CIK细胞中CD3+、CD56+双阳性细胞的百分率为（35.60±2.30）%,达最高峰,其后逐渐降低.故此可以认为,培养时间的延长有利于增强CIK细胞的细胞毒活性,但不是培养时间越长细胞质量越好,综合上述实验结果,笔者认为CIK细胞的最佳培养时间应为28d左右.笔者用MTT法测定CIK细胞对肺癌细胞株A549的杀伤活性,结果显示：效靶比为10∶1时,培养21d的CIK细胞杀瘤率是95%,达最高峰；当效靶比为20∶1时,培养21d的CIK细胞杀瘤率已达100%；当效靶比为40∶1时,培养14d的CIK细胞杀瘤率即可达到100%.由此可见增加效应细胞的数量,会大大提升对肿瘤细胞的杀伤力.至于在培养过程中什么因素导致CIK细胞数量上显著的增加,有人认为是抗CD3单抗对CD3+T细胞的刺激导致了CD56+细胞群通过细胞与细胞接触或分泌某种细胞因子而得以表达和扩增,但确切的机制尚待进一步研究.

[参考文献]

[1]钟国城,张小玉,孙薏,等.抗原致敏DC联合CIK在原发性肝癌治疗中的应用[J].中国肿瘤临床,2009,24（36）：1404-1408.

[2]黄建云,邓晖,高小华,等.健康人和肿瘤患者CIK细胞的生物学特性比较及应用[J].广东医学,2011,20（32）：2621-2624.

[3]要跟东,刘爱民,霍红旗,等.CIK细胞对鼻咽癌细胞株CNE―2Z的凋亡诱导作用研究[J].山东医药,2011,51（11）：65-66.

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