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【摘 要】目的:利用高效液相色谱法(HPLC),研究并建立了制备克感利咽口服液主成分色谱图的色谱方法.方法:色谱条件:KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈和0.25%甲酸水溶液,梯度洗脱,流量1.0mL/min,柱温22℃,用二极管阵列检测器记录各个色谱峰的紫外吸收光谱,色谱检测波长254nm.结果:在优化实验条件下,同时检测11种药效物质.结论:利用HPLC,从克感利咽口服液中鉴别出含有黄芩苷、黄芩素、绿原酸、栀子苷4种主要化学成分.【关 键 词】高效液相色谱,药效物质
Applicationofhighperformanceliquidchromatographyto
determinepharmacodynamicsubstancesinRheumandPharyngitisOralSolution
XIEChengen1D
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【Abstract】Objective:UsingHighPerformanceLiquidChromatography(HPLC),thechromatogramandpreparativemethodwerestudiedandestablishedforqualitativeanalysisonthechemicalpositionsofRheumandPharyngitisOralSolution.Methods:HPLCconditions:KromasilC18column(4.6mm×250mm,5μm),mobilephaseofacetonitrileand0.25%formicacidaqueoussolution,gradientelution,flowrate1.0mL/min,columntemperature22℃,withdiodearraydetectorrecordsofallchromatographicpeaksofUVabsorptionspectra,HPLCdetectionwavelength254nm.Results:Optimizationofexperimentalconditions,11kindsofpharmacodynamicsubstancescouldbedetectedinthesametime.Conclusion:TheuseofHPLC,identifyRheumandPharyngitisOralSolutioncontainingbaicalin,baicalein,chlorogenicacidandgeniposide,fourkindsofmainchemicalponents.
【Keywords】HPLC,pharmacodynamicsubstances
【中图分类号】R927.2【文献标识码】A【文章编号】1006-1959(2009)08-0152-02
应用现代仪器分析技术对中药成分进行分离和分析,结合药理学的药效试验,构成了探讨中药物质基础研究的基本方法.研究表明[1],克感利咽口服液由金银花、黄芩、栀子等14味中药材组成,对甲3型、乙型流感病毒以及呼吸道常见致病菌有杀伤和抑制繁殖作用.本研究利用HPLC方法对黄芩苷、黄芩素、绿原酸、栀子苷、升麻苷、连翘苷、甘草苷、甘草酸铵、5-0-甲基维斯阿米醇苷、次野鸢尾黄素、胡薄荷酮11种混合对照品及克感利咽口服液进行色谱分析,综合各样品色谱峰保留时间及紫外吸收光谱信息,建立克感利咽口服液主成分HPLC色谱图制备方法,对其中的主要药效物质进行定性检测.
1材料与方法
1.1仪器:Waters2695型高效液相色谱仪,2996PDA检测器,Empower色谱工作站(美国Waters公司).
1.2对照品及试品溶液制备:分别取对照品(中国药品生物制品检定所):黄芩苷0.00203g、黄芩素0.00153g、绿原酸0.00190g、栀子苷0.00141g、升麻苷0.00133g、连翘苷0.00138g、甘草苷0.00235g、甘草酸铵0.00230g、5-0-甲基维斯阿米醇苷0.00156g、次野鸢尾黄素0.00125g、胡薄荷酮0.00152g置10ml容量瓶中,加甲醇溶解,摇匀,定容至刻度,以0.45μm微孔滤膜过滤,滤液作为混合对照品供试溶液.精密吸取克感利咽口服液(广州王老吉药业股份有限公司)2ml,置25ml量瓶中,用50%甲醇稀释至刻度,摇匀,以0.45μm微孔滤膜过滤,滤液作为克感利咽口服液样品溶液.
本篇论文出处 http://www.sxsky.net/yixue/010705188.html
1.3试剂:甲醇和乙腈均为色谱纯(美国Tedia公司),甲酸为分析纯(天津市科密欧化学试剂开发公司),水为超纯水.
1.4方法:色谱条件为色谱柱:迪马KromasilC18柱(4.6mm×250mm,5μm),保护柱:PhenomenexKJ0-4282C18(4.0mm×3.0mm),二元梯度流动相,A为0.25%甲酸水溶液,B为乙腈,洗脱梯度:0―10min(2%B―5%B),10―30min(5%B―15%B),30―60min(15%B―30%B),60―75min(30%B―60%B),75―80min(60%B),80―85min(60%B―2%B),流速:1mL/min,柱温:22℃,检测波长:254nm,进样量:10μL.
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2结果与讨论
2.1色谱条件的选择:结合一些相关的文献报道[2-4],对色谱条件进行优化.实验分别以乙腈-0.25%甲酸水溶液为流动相1,甲醇-0.25%甲酸水溶液为流动相2,乙腈与甲醇流动相梯度变化.与甲醇相比,乙腈作为混合流动相中的有机相时,样品完成单个样品进样需时明显较短,而且所能提供的样品信息明显较多,色谱峰的分离度也较高.实验分别考察了甲酸、乙酸和磷酸对色谱峰的影响,固定水相中弱酸浓度为0.25%,分别以乙腈-0.25%甲酸水溶液为流动相1,乙腈-0.25%乙酸水溶液为流动相2,乙腈-0.25%磷酸水溶液为流动相3,分别以0.25%甲酸、乙酸和磷酸为昆混合流动相的水相时,对色谱图总体上并未表现出显著的差异,但在局部存在一定差异,甲酸优于乙酸,与磷酸效果类似.实验进而对甲酸浓度的选择进行了考察.不同浓度甲酸水溶液(1.0%、0.5%、0.25%)对色谱图并未表现出显著的差异,但在一些细节部位,0.25%浓度的甲酸获得的色谱峰有着更好的分离度,反映出更多一些信息.按照对样品稳定性及对色谱柱适用条件的选择原则,本实验验最终确定了1.4的流动相条件.在20~30℃色谱柱温对克感利咽口服液主成分色谱图并无显著影响,同时考虑到本实验所有仪器设备情况,实验选择色谱柱柱温22℃.
分别考察在不同检测波长(220nm、241nm、254nm、265nm、277nm、300nm、327nm、360nm)下的色谱图,其中以254nm下的信息量较为丰富,而且色谱峰的表观丰度高,选择254nm作为制备色谱图的检测波长.
因不同的色谱柱柱效可能存在差异,比较了四种不同的色谱柱对克感利咽口服液主成分色谱图的差异.色谱柱分别为:迪马KromasilC18柱,依利特HypersilODSC18柱,菲罗门LunaC18柱,沃特斯SymmetryC18柱,均为4.6mm×250mm,5μm.实验最终选择迪马KromasilC18柱用于制备色谱图.
2.2主成分色谱图特征峰的提取:作为一种的复方中药制剂,克感利咽口服液由14味中药组成中化学成分非常复杂,利用HPLC初步获得了色谱信息丰富、各色谱峰分离度较好而色谱分离时间相对较短(80min内)的克感利咽口服液主成分色谱图.通过与各对照品色谱保留时间及紫外吸收光谱比较分析,5号峰为绿原酸,7号峰为栀子苷,14号峰为黄芩苷,18号峰为黄芩素.
2.3稳定性试验:
取同一份供试品溶液分别在0、2、4、6、8、12、24h不同时间点进行检测,结果色谱各特征峰保留时间的RSD介于0.03%~0.94%,各特征峰保留时间稳定,色谱各特征峰峰高的RSD介于0.51%~4.66%,各特征峰峰高稳定,色谱图相似度皆在0.99以上,因而色谱图稳定,从而表明样品在24h内稳定.
2.4精密度试验:
取同一份供试品溶液,连续进样检测6次,结果色谱各特征峰保留时间的RSD介于0.01%~0.99%,各特征峰保留时间稳定,色谱各特征峰峰高的RSD介于0.55%~4.52%,各特征峰峰高稳定,色谱图相似度皆在0.99以上,因而色谱图稳定,从而表明仪器稳定,进样精密度良好.
2.5不同批次克感利咽口服液比较:对10批不同生产批次的产品进行HPLC分析,前面建立克感利咽
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