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1引言
维埃克斯(VX)、沙林(GB)作为神经性毒剂,具有高效强毒、快速杀伤的特点.检测VX和GB常用的方法有色谱法、色谱质谱联用法和波谱法等,这些方法的检测灵敏度虽然很高,但样品处理繁琐,分析时间长、成本高,且所需仪器复杂、价格昂贵、庞大笨重,需要专业技术人员操作和维护,不适用于现场快速检测\[1~3\].目前含磷毒剂生物传感器具有体积小、响应灵敏、快速、一般不需要对样品进行预处理等优点,已广泛用于毒剂的现场检测中,但这类传感器一般采用胆碱酯酶作为分子识别物质,对所有能抑制胆碱酯酶活性的含磷毒剂和氨基甲酸酯均有响应,无法区分毒剂种类\[4\].
适配子(Aptamer)是人工合成的单链寡核苷酸,具有亲和力高、特异性强、稳定性好及制备容易等优点,在生物传感器中作为一种新的分子识别物质正受到越来越多的重视[5,6].压阻式微悬臂梁将压阻材料集成于微悬臂梁中,通过惠斯通电桥将微悬臂梁的弯曲直接转换为电压信号进行输出\[7\].由于压阻式微悬臂梁读出方式简单、易于集成,成本低,体积小,在生化分子的现场检测中具有很好的发展前景\[8,9\].目前,有关微悬臂梁适配子传感器检测VX和GB及动力学分析方法尚未见文献报道.本研究的目的在于:(1)利用毒剂特异性的VX和GB适配子,建立一种基于压阻式微悬臂梁适配子传感器检测VX和GB的新方法,实现对VX和GB的高灵敏特异性检测,以解决现有含磷毒剂生物传感器无法区分毒剂种类的缺陷;(2)创建压阻式微悬臂梁适配子传感器检测VX和GB的反应动力学模型,为传感器的数据处理、噪声及非特异性信号干扰的排除提供理论依据.
2实验部分
2.1仪器与试剂
压阻式微悬臂梁检测平台由本室与北京大学微电子学研究院共同搭建(压阻式微悬臂梁传感芯片:长200μm,宽50μm,厚约1μm).VX和GB的甲醇储备液、VX适配子(5′BioTCGCAAGACGGACAGAAGGTTTTTATTTTATCTTTGATTACTGTTTTTTTGTTTAGTTGTGTTGGTGGAGCGATTTGT3′)、GB适配子(5′BioTCGCAAGACGGACAGAAGTTGGGACTGCCACTTTGTGTTTTGGTTATAGTACTTATTTGCGTTGGTGGAGCGATTTGT3′)均由本实验室制备;活化生物素(BiotinNHSester)、3,3,二巯基丙酸(DDPA)、1乙基3(3二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N羟基琥珀酰亚胺(NHS)、亲和素(Avidin)、乙醇胺(Sigma公司);牛血清白蛋白(BSA,上海国药集团有限公司);PBS缓冲液(pH7.4,0.01mol/L);其它试剂均为分析纯.实验用水为二次蒸馏水.
2.2实验方法
2.2.1微悬臂梁适配子传感器的构建将芯片置于检测池中,加入DDPA(5g/L),反应1h,使芯片表面金膜包被上羧基;以水清洗芯片及检测池,加入EDC(5g/L)和NHS(5g/L),反应0.5h,完成对微悬臂梁表面的羧基活化修饰;清洗芯片后自然晾干,滴加20μL100mg/L亲和素,反应0.5h;清洗后滴加20μL1mol/L乙醇胺,反应0.5h以灭活金膜表面残余的活化羧基;清洗后将芯片置于含PBS缓冲溶液的检测池中,加入2μmol/L生物素化的VX和GB适配子,反应2h,清洗芯片及检测池.
2.2.2VX和GB的检测将构建好的传感芯片置于含0.01mol/LPBS缓冲溶液的检测池中,待信号稳定后,加入不同浓度的VX或GB(一个芯片测量一个浓度),记录传感器的响应电压.另以0.01mol/LPBS及200μg/LO丁基甲基膦酰氯作为对照,考察传感器的特异性.
2.2.3微悬臂梁适配子传感器检测VX和GB毒剂动力学模型