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2006年上海市从黄浦江水样中检测出一株霍乱肠毒素（CT）阴性的O139群霍乱弧菌,对其表型及基因型做了系统的鉴定,现将结果报道如下.

1材料与方法

1.1菌株来源

O139群霍弧菌从本地区霍乱流行期间外环境水样中分离,菌号为9-06,参考菌株（O139群霍乱弧菌MO45）为本实验室提供.

1.2诊断血清

O1群霍乱弧菌多价血清、O139群诊断血清购自中国药品生物制品检定所,在有效期内使用.

1.3菌株鉴定

菌株鉴定按第五版《霍乱防治手册》中规定的步骤进行.

1.4药敏试验

采用WHO推荐的改良K-B纸片法.药敏试验用M-H培养基及其药敏纸片均由中国药品生物制品检定所提供,并在有效期内使用.药敏纸片包括复方新诺明（SXT）、强力霉素（DO）、庆大霉素（GEN）、氨苄青霉素（AM）、丁胺卡那霉素（AN）、诺氟沙星（NOR）、环丙沙星（CIP）.实验所用的药敏质控菌株大肠埃希氏菌ATCC25922为本中心微生物实验室提供,结果判断按照2005年美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）文件规定.

1.5毒素基因的PCR检测

以霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）、毒素协同调节菌毛亚单位A基因（tcpA）、辅助霍乱肠毒素基因（ace）、小带联结毒素基因（zot）为目标基因.ctxA、tcpA引物序列参照第五版《霍乱防治手册》步骤；ace、zot按照参考文献［1］方法；4种引物均由上海生工生物工程公司合成,其序列、扩增产物分子质量及编码产物名称见表1.以25μL扩增体系,PCR循环参数：预变性94℃ 5min,94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 60s循环35次,72℃延伸10min,然后取扩增产物8μL在1.5%含溴化乙锭琼脂糖凝胶上电泳,用Tannon GIS 2010凝胶成像系统成像.

1.6Riboprinter全自动指纹鉴定系统

使用美国杜邦公司RiboprinterDNA指纹图谱分析系统(RP)、酶切试剂（EcoRI/PVUII Riboprinter Kit）,进行16SrRNA条带分析,使用所有试剂均在有效期内.

2结果

2.1形态及生物学性状

此菌株为革兰阴性短小稍弯曲的杆菌,运动活泼.在双洗平板上菌落典型,呈圆形,边缘整齐,灰色半透明,湿润,扁平,中心有黑心；在TCBS平板上生长良好,菌落呈黄色；碱性蛋白胨水中生长迅速.山梨醇3h快发酵,菌株的其他生化反应,见表2.

2.2血清学试验

与O1群霍乱弧菌多价血清不发生凝集,与O139群霍乱弧菌单价血清呈"++++"凝集,生理盐水中不凝集.

2.3药敏试验

应用K-B法作药敏试验,结果见表3

2.4毒力基因检测结果

以霍乱弧菌毒力因子基因ctxA、tcpA、ace、 zot为目的基因设计引物,对菌株进行PCR扩增.电泳结果显示,此O139群霍乱弧菌9－06毒力因子基因检测均为阴性,参考菌株MO45除zot为阴性外,其余均为阳性,结果见图1、图2.

图1 O139群霍乱弧菌9-06四种毒力基因PCR检测结果

1-3为ctxA结果,分别为 9-06、(+)、(-) ；4-6为tcpA结果,分别为 9-06、(+)、(-)

7-9为 ace结果,分别为 9-06、(+)、(-)；10-12为zot结果,分别为 9-06、(+)、(-)

图2 MO45四种毒力基因PCR检测结果

1：ctxA结果 2:tcpA结果 3:ace结果 4:zot结果 5:阴性对照

2.5Riboprinter全自动指纹鉴定系统

使用EcoRI、PVUII进行双酶切,发现9-06与参考菌株（O139群霍乱弧菌MO45）酶切条带均不一致,见图3、图4.

3讨论

霍乱弧菌根据菌体抗原不同,可以分为200个以上O血清群,但仅发现O1群和O139群霍乱弧菌能引发霍乱.我国于1993年在新疆首次发现O139群霍乱弧菌爆发流行.

O139群霍乱弧菌的来源一直有争议,主要有两种说法［2］,即由埃尔托型霍乱弧菌（EVC）突变而来,或由非O1群霍乱弧菌获得EVC的毒力基因演变而来.Yamasakis等［3］研究发现,O139群基因群组特征与O1群,尤其是EVC流行株相似,表明O139群的出现是由非O1群的DNA片段通过水平基因转移导入埃尔托流行株编码O抗原区所致.而Shan等［4］自阿根廷一病人分离出一株CT阴性的O139群菌株,经核糖体分型等分析表明,该株O139与EVC和其他O139在基因上有较大差异,提示其不是起源于EVC,而可能是由其他非O1群霍乱弧菌发生基因重组获得O139的O抗原基因从而形成的变异株.同样有文献［5］表明O139群的非产毒株可能来源于非O1、非O139群菌株.

9-06分离自外环境,为非产毒O139群霍乱弧菌,毒力基因(ctxA、tcpA、zot、ace)均为阴性,我国其它地区也有类似菌株发现,如杭州等地［6］.本实验结果发现,O139群霍乱弧菌中,ctxA阳性菌株（MO45）和ctxA阴性菌株（9-06）对SXT的耐药显著不同,分别表现为耐药和敏感.16SrRNA基因高度保守,在所有细菌基因组中存在多个拷贝,素有“细菌化石”之称,利用16SrRNA保守基因进行核糖体分型(RT),分别用EcoRI、PVUII进行双酶切, RT带谱不同,这与文献报道一致［7］.实验结果表明,携带ctxA毒力基因的O139群霍乱弧菌和未携带ctxA毒力基因的O139群霍乱弧菌在表型及其基因型上有显著差异.

4参考文献

［1］Singh DV, Maria H,Matte. Molecular analysis of vibrio cholerae 01,0139,non-01, and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates［J］. Applied and Environmental Microbiol, 2001,67(2):910-921.

［2］段广才,高守一,祈国明,等.霍乱弧菌O139菌株的分子生物学特征［J］. 河南医科大学学报,1998,33(3):43-47.

［3］amasaki S, Shimizu T, Hoshino K, et al.The genes responsible for O-antigen synthesis of vibrio cholerae O139 are closely related to those of vibrio cholerae O22［Jᦆ