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摘 要 原位杂交法近年来广泛用于生物和医学领域,其实验技术有很强的应用价值.阐述了病原微生物原位杂交检测法的实验地位和作用、实验课的设计思路和实验内容.

关 键 词 病原微生物；原位杂交；地高辛标记；实验综述

中图分类号 R446.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）09-0335-01

根据安庆师范学院生命科学学院课程设置情况,微生物学是主干基础学科,且学校注重学生实践技能的培养.结合生命科学前沿动态,病原微生物关系到居民生活和健康,是近年来的研究的热点.以地高辛标记的原位杂交技术,在医学、免疫学和基因组学等领域发展十分迅速,以应用性为导向,制定了该实验方案.

1.实验原理

1.1 病原微生物

病原微生物是指侵入机体后引起感染的病原体.常见的病原微生物有大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等.

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1.2 原位核酸分子杂交技术

简称原位杂交技术.可将特定的基因或者核酸序列直接定位在染色体上,其灵敏度和敏感性高,不用提取组织核酸而且不受细胞中其他成分影响,较好地保存了细胞结构和形态.可用于外源DNA的鉴定,本实验用于定性和定位病原微生物.将细胞经适当处理后,其通透性增加,用标记好的序列已知的核苷酸单链作为探针,进入细胞,根据碱基互补配对的原则,与组织或细胞中待检测的核酸序列,发生特异性结合,形成杂合体.选择与标记物对应的检测系统,使用荧光检测或者化学显色的方法,杂交体在细胞原位形成带有颜色的杂交信号[1].

1.3 随机引物法地高辛标记探针原理

以DNA单链为模板,合成双链的过程中,用同位素标记4种核苷酸底物中有1种,则在与模板序列配对的许多位置,会形成放射性探针；若用DIG-11-dUTP代替dTTP,则产生地高辛标记的探针.标记的探针DNA 的平均长度越长,引物的浓度越低[2].

1.4 探针的选择

用于原位杂交的探针有RNA、ssDNA和dsDNA.如用于检测RNA样品,称为Northern杂交；如用于检测DNA样品,称为Southern杂交.根据病原微生物种类选择合适的探针,可根据探针来源和性质分为DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等[3].探针长度一般在100～400个碱基,寡聚核苷酸探针（16～30个碱基）,短核苷酸探针能自由出入细菌细胞壁,杂交效率比长探针高.

1.5 标记物的选择

标记物可以是放射性同位素,也可以是非放射性生物素和半抗原等.但因同位素对人体伤害较大,近年多选取非放射性物质进行标记.本文选用地高辛标记系统[4].

2.实验内容

2.1 实验课的目的

了解检测病原微生物的常用方法；掌握原位杂交实验原理和操作方法；了解原位杂交技术的应用.

2.2 实验材料

供试菌株为单增李斯特氏菌；供试试剂为地高辛标记及检测试剂盒；U-NIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒；DNA胶回收试剂盒.

2.3 实验步骤

2.3.1 核酸探针的制备.引物设计合成：根据单增李斯特氏菌的保守区域,设计1对引物,即P1：5′-ACAATTCATCTAG TGCGT-3′；P2：5′-CCACCTATACCAGTTGAC-3′.

2.3.2 RT-PCR扩增上述保守区域.按UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒说明,抽提单增李斯特氏菌总RNA,采用一步法RT-PCR进行扩增.琼脂糖凝胶电泳检测后,按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明回收DNA片段.

2.3.3 地高辛标记该基因片段.模板DNA浓度：取回收获的DNA片段,用Nanodrop超微量核酸蛋白测定仪,测核酸浓度.10 ng/μg 模板DNA用双蒸水补足至16 μL.双链DNA变性成单链：98 ℃加热10 min,迅速冰浴冷却.取4 μL DiG-high Primer与变性后DNA充分混匀,并离心.37 ℃温育过夜.终止反应：加2 μL 0.2 moL/L EDTA（pH值 8.0）或65 ℃加热10 min.

2.3.4 探针标记效率与灵敏度测定.将对照DNA和标记好的探针分别按试剂盒说明进行稀释后,点样于硝酸纤维膜上,按试剂盒说明进行显色.

2.3.5 点样.将单增李斯特氏菌的菌液滴在硝酸纤维膜上进行点样.

2.3.6 细胞的固定.用4%多聚甲醛室温下固定2 h单增李斯特氏菌,用1×PBS漂洗3次,每次5 min,梯度乙醇脱水,每级5 min.用2张滤纸包住膜,置于真空干燥箱中,80 ℃固定2 h.

2.3.7 蛋白酶K消化.在单增李斯特氏菌细胞涂片上覆盖1层10 mg/L的蛋白酶K溶液,37 ℃消化10 min,PBS漂洗3次,每次5 min,然后放入4%多聚甲醛后固定5 min,PBS漂洗2次,每次5 min,2×SSC漂洗2次,每次5 min,100%乙醇脱水1 min,室温干燥.

2.3.8 杂交.预热一定体积的DiG Easy Hyb（10 mL/100 cm2膜）至杂交温度37～42 ℃.预杂交：不加探针的情况下,将膜放在杂交液中42 ℃下充分润湿30 min.再加入变性后的探针.将变性的探针加入预热的DIG Easy Hyb（3.5 mL/100 cm2）中,混匀.加入探针和DIG Easy Hyb混合液,42 ℃下杂交过夜.洗去多余的探针：新鲜配置40 ℃,2×SSC,洗2次,每次5 min.0.5×SSC洗1次,温和振荡15 min.

2.3.9 封闭.加入马来酸缓冲液浸泡5 min.再加入封闭液温育30 min,使抗体非特异性位点饱和. 2.3.10 中止反应.稀释抗体-DIG-抗原偶联物至150 mU/mL,滴加至膜上,37 ℃ 60 min.用100 mL 洗液洗膜15 min,洗2次.在10 mL新鲜配制的颜色底物中处理膜5 min,勿摇动,于暗处保存.当预期的斑点出现时,可在50 mL水中洗膜5 min中止反应.采集结果图像.

3.实验结果

单增李斯特氏菌基因片段的RT-PCR扩增：产物进行琼脂糖电泳时,出现500 bp左右条带,与预期的扩增片段大小一致.地高辛标记效率与灵敏度检测：对照DNA和标记探针颜色深度相似,表明探针标记的效率合格.单增李斯特氏菌禽流感病毒细胞内原位杂交：未加探针的对照细胞也没有出现阳性信号,加探针的单增李斯特氏染色清晰,结构完整.

4.注意事项

标本的固定条件、标本组织蛋白质的消化程度很重要,一定要用蛋白酶K充分消化,去除与核酸结合的蛋白质和杂蛋白,从而使DNA分子充分暴露出来,才能提高结合效率,增加杂交的效率.若固定不充分,杂交时探针不能穿过细胞,会留下