药用辅料构橼酸的细菌内毒素检查方法探索

药用辅料构橼酸的细菌内毒素检查方法探索

【摘要】建立适合本公司注射剂使用的药用辅料枸橼酸的细菌内毒素检查方法。【关键词】枸橼酸细菌内毒素检查干扰试验方法：依照《中国药典》2015年版二部附录细菌内毒素检查法试验和结果判断，采用pH调节法进行试验。
结果：以湛江安度斯生物有限公司生产的市售稀释剂Ⅱ对构椽酸原液进行稀释，对鲎试剂与内毒素反应最大不产生干扰的浓度为0.25mg?ml-1，使用0.O6EU?ml-1或灵敏度更高的赏鲎剂可对其进行细菌内毒素检查。
结论：本细菌内毒素检查法多次试验结果均符合规定，可用于其质量控制。
枸橼酸又名柠檬酸，是一种重要的药用辅料，其易溶于水，常温下为无色晶体。药典四1143细菌内毒素检查法供试品溶液的制备中规定，必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲液调节pH值。常用细菌内毒素检查用水稀释法和碱性试剂中和法，前者稀释步骤较多，后者每次进行试验均需要进行pH调节，耗时较长。故而本文采用稀释剂Ⅱ进行稀释和调节。
一、实验材料
枸橼酸（湖南华日制药有限公司，批号20180407，20180408，20180409）；细菌内毒素工作标准品（WSE）；鲎试剂（TAL，批号1610311，0.25EU?ml-1，湛江安度斯生物有限公司；批号1801153，0.06EU?ml-1，湛江安度斯生物有限公司；批号1802207，0.O6EU?ml-1，湛江博康海洋生物有限公司）；细菌内毒素检查用水（BET，湛江安度斯生物有限公司）；稀释剂Ⅱ（批号1709120，4ml?Amp-1，湛江安度斯生物有限公司）。
二、方法与结果
（1）细菌内毒素限值的确定L=0.5EU?mg-1。
（2）鲎试剂灵敏度复核参照药典方法，进行鲎试剂的灵敏度复核试验。三种鲎试剂的灵敏度均在0.5λ～2λ之间，可用于细菌内毒素检查。
（3）干扰预试验。考虑到现有鲎试剂分别为0.25，0.125，0.06和0.03EU?ml-1四个灵敏度。依据公式MVC=λ/L，有效稀释浓度为0.5～0.0625mg?ml-1。选取灵敏度为0.25EU?ml-1的鲎试剂进行干扰预试验。将20180407批的枸橼酸以BET水溶解，制成10mg?ml-1的原液。以稀释剂Ⅱ对其稀释，使其终浓度分别为1，0.5，0.25，0.125，0.0625mg?ml-1，将浓度为0.5，0.25，0.125，0.0625mg?ml-1系列溶液记为NPC；同时在浓度为1，0.5，0.25，0.125mg?ml-1溶液中添加等体积4λ浓度的内毒素溶液，使每一浓度试验液中均含有2λ浓度的细菌内毒素，将此系列溶液记为PPC。取灵敏度为0.25EU?ml-1的TAL分别与上述NPC和PPC进行反应，每一浓度重复做2管。结果表明，枸橼酸的最高不干扰浓度为0.25mg?ml-1。
（4）正式干扰试验依据上述预实验结果，选择0.125mg?ml-1为样品的不干扰浓度，选择0.06EU?ml-1的TAL进行正式干扰试验。以稀释剂Ⅱ将枸橼酸原液分别稀释至终浓度为0.25mg?ml-1和0.125mg?ml-1，以0.125mg?ml-1溶液作为供试品对照液，试验重复2管。用0.25mg?ml-1的枸橼酸溶液将WSE配成浓度为2λ，λ，0.5λ和0.25λ四个系列浓度，试验重复4管。用BET水将WSE配成2λ，λ，0.5λ和0.25λ四个系列浓度，试验重复2管。同时以BET水为阴性对照，试验重复2管。用灵敏度为0.O6EU?ml-1的TAL进行干扰试验。当供试品对照液和阴性对照均为阴性时，结果按公式Es=1g-1（∑Xs/4）和Et=1g-1（∑Xt/4）计算，其中Xs和Xt分别为BET系列和枸橼酸系列各反应终点细菌内毒素浓度的对数值。干扰试验结果见表1和2。
结果表明，阴性对照为阴性且Es在0.5λ～2λ之间，试验有效。Et在0.5λ～2λ之?g，符合规定。
参考文献：
[1]肖佳音，李庆忠，陈志勇.注射用药用辅料枸橼酸细菌内毒素检查法的可行性研究J].中国药品标准，2013.
[2]陈莉英，付经国，娄维娜等.枸橼酸原料质量标准“细菌内毒素检查法”方法学研究[J].药学分析杂志，2003.